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LE CLUB DE LA TRANSPLANTATION Infections virales et transplantations 6 et 7 Octobre 2005.

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2 LE CLUB DE LA TRANSPLANTATION Infections virales et transplantations 6 et 7 Octobre 2005

3 RESISTANCE DU CYTOMEGALOVIRUS AUX ANTIVIRAUX APRES TRANSPLANTATION S. ALAIN, CHU Dupuytren, Limoges

4 Le Cytomégalovirus Virus de la famille des Herpesviridae Ubiquitaire Persiste sous forme latente après la primo- infection

5 La physiopathologie de linfection favorise lémergence de résistances

6 Linfection à CMV Infection symptomatique après transplantation dorgane solide –Rein-pancréas : 50% –Cœur-poumon : 39-41% –Foie et pancréas : 22-29% –Cœur et rein : 8-35% Résistance aux antiviraux après transplantation : –0-13%

7 La résistance du CMV aux antiviraux, essentiellement au GCV, après transplantation est préoccupante à plus dun titre : –Elle augmente la fréquence des épisodes de virémie, symptomatiques ou non, –Elle accélère le développement de la maladie à CMV, –Elle favorise le rejet de greffe –Elle augmente la mortalité. (Bhorade et al., J. Heart Lung Transpl., 2002)

8 Qu appelle-t-on résistance au traitement? La persistance d une réplication virale sous traitement bien conduit définit la résistance clinique –Causes pharmacologiques/immunologiques/virologiques La mise en évidence d une souche résistante par l étude du phénotype ou du génotype définit la résistance virologique

9 Comment aborder l étude des résistances? Quels en sont les mécanismes moléculaires ? Comment émerge une souche résistante ? Quand et Comment la rechercher ? Que représentent les résistances en transplantation d organe ? Quelles conduites peut-on proposer ?

10 Mécanismes moléculaires de résistance du CMV aux antiviraux

11 ADN polymérase UL54 UL97 GCV-PPPCDV-PP PFA Foscarnet PFA Ganciclovir GCV Cidofovir CDV GCV-PP GCV-P CDV-P Kinases cellulaires Les molécules antivirales disponibles inhibent lADN polymérase virale

12 Prodrogues : ADN polymérase UL54 UL97 ACV-PP ACV-PPP GCV-PP GCV-PPP Aciclovir GCV Val-GCV ACV Val-ACV Valaciclovir L-Valine

13 GanciclovirCidofovirFoscarnet Résistance isolée au ganciclovir Par défaut de phosphorylation UL97 Résistance au cidofovir Et Au ganciclovir Résistance au foscarnet Mutation Résistance croisée UL54 Mutation Association de résistances

14 gB, gH 1 Cycle intracellulaire du CMV pp65 IE72 IE E L UL54 Terminases UL97, UL27 pp65 EGFr

15 gB, gH 1 Site daction des antiviraux pp65 IE72 IE E L UL54 Terminases UL97, UL27 EGFr Benzimidazolés Maribavir GCV, CDV, FOS

16 UL97 Sérine-thréonine Kinase de 707 aa, 78KDa Activée par autophosphorylation Indispensable à la sortie des particules virales hors du noyau Substrat naturel inconnu Phosphoryle accessoirement le GCV maribavir, avec UL27

17 Localisation des principales substitutions d'acides aminés responsables de la résistance au ganciclovir dans la phosphotransférase UL97 : Plus de 70 % des mutations de résistance connues sont situées entre les acides aminés 460 et 607 IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXI NH2COOH

18 UL54 ADN Polymérase ADN dépendante, 140KDa, 3 ->5 exonucléase Associée à une protéine accessoire UL44 Assure la réplication du génome viral

19 IV -region C IIVIIIIIVIIV NH2 COOH D Localisation des principales substitutions d acide aminé responsables de résistance dans UL54 Résistance au cidofovir : Résistance au ganciclovir et au cidofovir : Résistance au foscarnet Résistance au ganciclovir et au foscarnet : Exo I Exo II Exo III 301

20 Quels sont les mécanismes démergence dune souche résistante?

21 Avant traitement Traitement Après traitement Souche sauvage (Cycle viral normal) Souches mutantes Blocage du cycle viral des souches sensibles Prédominance de la souche résistante Prédominance de la souche sauvage Réplication virale => mutations+/-favorables Sélection

22 Influence des mutations sur la sélection des résistances Les mutations de UL97 sont les premières à apparaître –Elles confèrent un niveau de résistance modéré au GCV (CI50 < 30) –Diminuent peu ou pas la capacité réplicative du virus mutant Les mutations de UL54 apparaissent plus tardivement –Elles confèrent un niveau de résistance élevé –Mais diminuent la capacité réplicative du virus

23 Influence des mutations de UL54 sur la capacité réplicative du virus (Springer et al., J Clin Microbiol, 2005) (Ducancelle et al., J Clin Virol., 1999)

24 Emergence d une souche résistante in vivo Emery, J exp.Med., 1999; J. clin. Virol, 2001 Cinétique virale au cours d une infection à CMV non traitée : –temps de doublement de la population 1 à 2 jours Décroissance virale sous traitement : –1/2 vie 1 à 2 jours Emergence du mutant : –La souche mutée préexiste au traitement, devient dominante sous traitement puis redevient indétectable à l arrêt du traitement Traitement 200copies/ml Copies/ml Mutant Sauvage T 21j En compétition

25 Quels sont les facteurs de risque de résistance? Existe-t-il des facteurs prédictifs ?

26 Statut sérologique D+/R- Utilisation danticorps anti-lymphocytes (SAL) Transplantation pulmonaire ou rein-pancréas Réplication virale intense –Charge virale élevée (Nle : 4-6 log) –Augmentation rapide de la virémie Episodes répétés de maladie à CMV Administration prolongée dantiviral (prophylaxie > TT anticipé) Concentration plasmatiques suboptimales de lantiviral au site de linfection –Mauvaise biodisponibilité (GCV oral) –Toxicité nécessitant des réductions de dose Emergence d une souche résistante : Facteurs de risque après transplantation dorgane (1)

27 Facteurs de Risque de résistance (2) Absence dassociation entre génotype gB CMV et maladie à CMV ou résistance

28 La charge virale circulante permet-elle de prédire lémergence de résistance après transplantation ? Sous traitement : –Disparition de lantigénémie en 10 à 15 jours –Négativation de la PCR en jours Valeur prédictive de la pente de décroissance ? Emery et al., 2001

29 La décroissance virale sous traitement lors du premier épisode dinfection à CMV est prédictive des récurrences, en labsence de résistance Humar et al., JID, 186, 2002

30 FDR de récurrence Environ 60 jours après le premier épisode de maladie à CMV (ganciclovir et valaciclovir) Absence de clearance virale à lissue du premier traitement p<0,001 Augmentation du délai de clearance virale 17,2js ->33,8

31 Quand craindre lémergence dune souche résistante? Devant une augmentation ou une persistance de la charge virale (PCR ou antigénémie) sous traitement à dose efficace chez un patient ayant été exposé de façon prolongée à un antiviral (prophylaxie ou traitements répétés) Ce dautant que ce patient présente dautres facteurs de risque de résistance La réponse retardée au traitement ne traduit pas systématiquement une résistance, mais représente un facteur de risque de récurrence, à surveiller. Lélévation de lantigénémie dans les 2 premières semaines dun traitement est possible. Elle nest pas associée à une résistance. (Gerna et al., JID 2003; Nichols et al., Blood 2001)

32 Comment mettre en évidence une souche résistante ?

33 Méthodes de détection des résistances Phénotype : Définit la concentration inhibitrice 50% et 90% de l antiviral testé Nécessite l isolement du virus en culture cellulaire Long et difficile à standardiser Etudie le comportement du virus quel que soit l antiviral ou les mutations (nouveaux antiviraux) Foyer de Cellules infectées

34 Mesure des CI50 et CI90 sur virus titré Interprétation du phénotype : CI50 du virus testé = IS50 > 3 CI50 souche sensible de référence

35 Mesure en échiquier Antagonisme-indifférence-synergie Concentrations de foscarnet M Concentrations de ganciclovir en M

36 Génotype : Recherche les mutations de résistance dans un gène donné : UL97 ou UL54 Directement dans le prélèvement Plus sensible que le phénotype Permet la détection de mutations nouvelles Non standardisé pour le CMV : –Absence de banque de données sur les mutations de résistances –Sensibilité variable des méthodes de génotypages : de 10% à 50% Méthodes de détection des résistances Amplification par PCR séquence Interprétation Du génotype RFLP Rapide non exhaustif

37 Corrélation génotype-phénotype La mise en évidence dune mutation connue est corrélée à la résistance clinique et phénotypique Lorsquune nouvelle mutation est observée, sa responsabilité dans la résistance doit être démontrée –Par étude du phénotype des souches mutées –Par transfert de la résistance à une souche sauvage –Par étude de lactivité enzymatique de la polymérase en présence de lantiviral

38 La présence de mélanges de souches peut être un obstacle à la détection des résistances Les souches testées sont le plus souvent les souches circulantes. Les souches mutées peuvent être sélectionnées au site de linfection. Les souches mutées minoritaires peuvent ne pas être détectées, voire être perdues lors de lisolement viral Chez un patient multitraité peuvent coexister des souches résistantes à différents antiviraux

39 Souche sauvage (Cycle viral normal) Souche mutée Antiviral Expansion de la souche résistante Isolat sauvage Souche mutée minoritaire Les techniques de séquençage doivent être standardisées et sensibles La sensibilité dépend de la méthode de séquençage La détection précoce des souches résistantes est nécessaire

40 Patiente B. Lymphome Ducancelle et al., J.Clin Virol, 2005

41 Etude épidémiologique des isolats séquentiels Isolat B3 : GCV/CDV R, PFA S 3 souches

42 Consensus Sense Antisense AD169 N495N/KL501I/L

43 ATCAACACTATGAAGTATCCCAACTCGAACAAGGCCACTAD 169 Non détectée

44 Que représente la résistance aux antiviraux en pratique clinique après transplantation?

45 Les leçons du VIH : Incidence de la résistance Traitement cumulé Ganciclovir 1 valganciclovir 2 cidofovir 3 Foscarnet 3-4 3mois7%2%29%0-9% 6mois12%7%13-26% 9 mois27%9%24-37% 12 mois27%13%37% 1 : Jabs et al, JID 1998; 2 : Boivin et al., JID 2001; 3: Jabs et al., AAC 1998; 4 : Weinberg et al., JID 2003

46 Résistance du CMV aux antiviraux après transplantation d organe (Lurain, JID, 2002) 2 cohortes de patients : –Cleveland : 2345 patients suivis de 1990 à 2001 (Etude prospective) –Chicago : 200 patients présentant une infection active à CMV (Etude rétrospective) –Tous sous GCV en prophylaxie ou traitement Recherche des souches résistantes circulantes Phénotype et génotype

47 Cohorte de Chicago (Lurain, JID, 2002)

48 Cohorte de Cleveland (Lurain, JID, 2002)

49 Facteurs de risque (Lurain, JID, 2002) Transplantation pulmonaire Statut D+/R- (28/30 patients hébergeant une souche résistante) Plusieurs mois ou années de traitement cumulé

50 Mutations : 19 patients -cohorte de Chicago (Lurain, JID, 2002) Résistance confirmée par le phénotype UL97 : 19/19 (100%) des patients ->codons 460 à 607 UL54 : 6/19 (30%) ->Résistance croisée au cidofovir (5/6) ->résistance associée au foscarnet (1/6, traité par foscarnet) Délai d apparition des mutations : UL97 : 5,5 à 36 mois UL54 : 5 à 13 mois, toujours après UL97

51 Les traitements prophylactiques sont- ils pourvoyeurs de résistance? En faveur : Inhibition incomplète de la réplication virale –Val ACV =ACV < GCV –GCV oral=> 45% versus 91% GCV IV –Val GCV = GCV n empêchent pas la primo-infection (infection active pendant ou à l arrêt de la prophylaxie) administration prolongée En défaveur : Faible charge virale sous traitement Réversion de la population à l arrêt du traitement

52 Résistance du CMV après prophylaxie par ganciclovir oral (Limaye, Lancet, 2000) Toutes les souches résistantes portent des mutations dans UL97 en position 460, 594 ou 595

53 Résistance du CMVaprès prophylaxie par ganciclovir oral : facteurs de risque (Limaye, Lancet, 2000) Primo-infection (Charge virale élevée) : D+/R- (5/67, 7% versus 0/173) Immunodépression : Greffe de pancréas +/- rein (4/19, 21% versus rein 1/20, 5%)

54 Prophylaxie par GCV et résistances TraitementOrganeCirconstancesMutantssuiviN (%) GCV oralTousMaladie à CMV UL971 an5/240 (2,1)Limaye, 2000 GCV oralTousSystématiqueUL974m 1 an 2/103 (1,9) 1/33 (6,1) Boivin 2004 GCV oral # PoumonSystématiqueUL976m 1 an 1/40 (2,5)Humar 2005 Val GCVTousSystématique/4m 1 an 0Boivin 2004 Val GCV # PoumonSystématiqueUL97/ UL54 6 m 1 an 1/40 (2,5) Humar 2005 Val GCV*ReinMaladie à CMV />1 an0Gruber, 2005

55 Résistance du CMV après traitement « préemptif » par ganciclovir IV en transplantation pulmonaire (Limaye, JID, 2002) 45 patients D+/R+ et D+/R- TT préemptif GCV IV 5mg/Kg/J x 2 n = 37 Prophylaxie GCV IV 5mg/Kg/j n = 8 Maladie à CMV due à une souche résistante au GCV 3/181/2 10%

56 Prophylaxie et résistances Valaciclovir Alain et al., 2004 : 27 receveurs de rein virémiques pendant ou à larrêt de la prophylaxie (suivi 1 an) –Recherche systématique de résistance : 1/27 (3,8%) : UL97 M460I, sans conséquences cliniques, clearance spontanée du virus. Pavlopoulou et al., 2005 : 83 receveurs de rein Val ACV (43) versus GCV oral (40) –Aucune suspicion de résistance pendant les 6 mois post- greffe

57 Evolution de la patiente BE. Fa VCV MMF AZA Leucopénie Detection M460I

58 Sélection précoce de résistance au GCV après valaciclovir chez un transplanté rénal (Hantz etal., AAC 2005)

59 Traitement préventif et résistances Deux tableaux se discernent : –Résistances précoces : au cours ou à la fin de la prophylaxie Peu de conséquences cliniques Disparition spontanée de la virémie Associées à des charges virales faibles ou modérées (1000 à copies) persistantes –Résistances tardives survenant dans la première année Après plusieurs expositions aux antiviraux associées à une maladie à CMV de pronostic plus réservé Associant parfois plusieurs souches

60 Quelles alternatives peut-on envisager? Association de deux molécules (ganciclovir et foscarnet) Alternatives thérapeutiques : –Baisse de limmunosuppression (Anglicheau et al., 2003) –Nouveaux antiviraux

61 Conclusion 1 L émergence de souches résistantes après transplantation d organe est possible, sous traitement prophylactique, anticipé, ou curatif. Elle est favorisée par : –Des traitements sub-inhibiteurs prolongés avec persistance d une réplication virale –Une profonde immunodépression –Une charge virale élevée (antigénémie ou ADNémie) –Un statut D+/R- Et doit donc être recherchée chaque fois qu une réplication virale persiste sous traitement bien conduit, malgré la levée de l immunosuppression C est pourquoi tout traitement anti-CMV, même prophylactique justifie une surveillance virologique

62 Conclusion 2 La mise en évidence d une souche résistante associe: –Un test moléculaire sur sang total ou leucocytes (tube EDTA) –Un isolement des souches virales circulantes (virémie, tube hépariné) chaque fois que possible –Une étude des souches au site de l infection en cas de maladie à CMV

63 Observatoire de la résistance du CMV aux antiviraux après transplantation dorgane et greffe de moelle Centre National de Référence du Cytomégalovirus 1) Enquête rétrospective sur les prélèvements de lannée 2004, en cours 2) Enquête prospective avec recueil de données cliniques et virologiques et recueil systématique de prélèvement devant toute infection à CMV 3) Possibilité dobtenir, sur envoi de souche ou de prélèvement, une recherche de résistance sous 8 jours.


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