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Les examens biologiques en Hématologie Rémi Letestu Laboratoire dHématologie CHU Avicenne UFR SMBH DCEM1 (2006-07)

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1 Les examens biologiques en Hématologie Rémi Letestu Laboratoire dHématologie CHU Avicenne UFR SMBH DCEM1 ( )

2 plaquettes éosinophiles neutrophiles monocytes érythrocytes macrophages basophiles B T SANG lymphocytes Hématopoïèse réticulocytes mégacaryocyte s Progéniteurs lymphoïdes CFU-GEMM BFU-E CFU-E MOELLE OSSEUSE Tpo Cellules souches

3 Les différents examens SANG NFS ou hémogramme Frottis sanguin GANGLION (adénopathie) Ponction gg Biopsie gg MOELLE OSSEUSE Myélogramme Biopsie médullaire BIOPSIES Chirurgicales ou à laiguille

4 Les différentes techniques CYTOLOGIE Cytochimie HISTOLOGIE ou ANATOMO-PATHOLOGIE CYTOMETRIE EN FLUX ou IMMUNOPHENOTYPAGE CYTOGENETIQUE BIOLOGIE MOLECULAIRE

5 Hémogramme ou NFS Définition: analyse quantitative et qualitative des éléments figurés du sang –Décompte des GR, GB, et plaquettes par unité de vol de sang (numération) –Décompte des sous-types de GB (formule sanguine) –Analyse morphologique de ces éléments

6 La Numération Formule Sanguine (NFS) –Ponction de sang veineux –Prélèvement sur anticoagulant : EDTA –Compteurs Automatiques : importance des contrôles ++

7 Valeurs Normales de l Hémogramme La Numération –Globules Blancs : 4-10x10 9 /L 4-15x10 9 /L –Plaquettes : x10 9 /L20 x10 9 /L –Globules Rouges –H : x10 12 /L F : x10 12 /L –E : x10 12 /L NRS : 5-6 x10 12 /L –Hémoglobine (Hb) –H : g/dL F : g/dL –E : g/dLNRS : g/dL –Hématocrite –H : 40-54% F : 35-47% –E : 36-44%NRS : 44-62%

8 Valeurs Normales de l Hémogramme Les Réticulocytes –Automates / Coloration sur lame (/1000 GR) –Environ 1-/120° des GR –Expression en valeur absolue –25000 à quand Hb Normale La Formule –Polynucléaires Neutrophiles : 1.7-7x10 9 /L –Polynucléaires Eosinophiles : 0-0.5x10 9 /L –Polynucléaires Basophiles : x10 9 /L –Lymphocytes : 1.5-4x10 9 /L –Monocytes : 0.1-1x10 9 /L

9 Valeurs Normales de l Hémogramme Les constantes de Wintrobe –Volume Globulaire Moyen (VGM) fl (83-97) –Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb (CCMH) 32-36% –Teneur Corpusculaire Moyenne en Hb (TCMH) pg/cellule

10 Frottis sanguin Technique –Étalement dune goutte de sang sur une lame –Coloration May-Grünwald-Giemsa (MGG) –Analyse au microscope Indications –Diagnostic danomalies morphologiques Des GR Des GB Des plaquettes –Recherche et identification de cellules anormales myélémie, blastes cellules lymphomateuses –Vérification du nombre de plaquettes++

11 Quand prescrire un Hémogramme en urgence Etat de choc Pâleur intense, asthénie, Angine ulcéro-nécrotique ou résistante aux antibiotiques Fièvre élevée après prise de médicament, surtout après chimiothérapie anti-mitotique Fièvre résistante aux antibiotiques Purpura pétéchial, syndrome hémorragique

12 Valeurs de lhémogramme indiquant une consultation spécialisée en urgence Hématocrite supérieur à 60 % Anémie inférieure à 7 g/dl ou mal tolérée Neutropénie inférieure à 200/mm3 (0.2 G/L) Hyperleucocytose faite de cellules immatures supérieure à /mm3 Thrombopénie inférieure à /mm3 (20 G/L) même sans syndrome hémorragique Après élimination dune fausse thrombopénie à lEDTA

13 Le Myélogramme Historique – Arinkin-1935 Mallarmé Ponction Sternale / Iliaque Post > Antérieure Indications –Nombreuses : toute suspicion danomalie centrale de production des éléments du sang Anémies normo ou macrocytaires arégénératives et/ou Neutropénies et/ou Thrombopénie Pancytopénie Pic monoclonal –Diagnostic –Analyses spécialisées Contre-indications –Très rares - E nfant - Contre indication sternale –Troubles graves de la coagulation

14 Le Myélogramme Précautions –Indispensables –Chez l enfant –Formation au geste –Règles strictes Déroulement du geste –Anesthésie locale –Ponction –Réalisation des frottis : point essentiel Trocart de type Mallarmé Trocarts de type Jamshidi

15 Le Myélogramme –Quantité & Qualité de la Moelle Osseuse –Cellules à l origine des éléments circulants –Exploration des lignées Myéloïde et Lymphoïde

16 MB Myéloblaste PML Promyélocyte MLN Myélocyte neutrophile MMLN Métamyélocyte PN Polynucléaire neutrophile La lignée granuleuse neutrophile

17 La lignée érythroblastique PROER Proérythroblaste ERB Érythroblaste basophile ERP Érythroblaste polychromatophile ERA Érythroblaste acidophile

18 L Adénogramme Organe lymphoïde Exploration des lignées Lymphoïdes Ponction aiguille Frottis Facile, non douloureux, informatif ++

19 Les Biopsies Chirurgicales Masse tumorale (lymphomes) Ganglion : La biopsie ganglionnaire A laiguille Sous Scanner La Biopsie Ostéo-Médullaire (BOM)

20 La biopsie ganglionnaire Prélèvement ganglion entier par technique chirurgicale Morphologie, coupes histologique Immunomarquages sur lame –immunocytochimie Suspension de cellules

21 La biopsie ostéomédullaire (BOM) Historique – Arinkin –1950 développement Ponction Iliaque Post Indications –Nombreuses –Diagnostic et Bilan d extension –Analyses spécialisées Contre-indications –Rares –Troubles graves de la coagulation –Thrombopénie sévère, thrombopathie Déroulement du geste

22 La Cytométrie en Flux Mélange cellulaire hétérogène et complexe Injection de la suspension cellulaire Liquide de gaine sous pression Etirement de la veine liquide Alignement et passage des cellules une par une dans la chambre d analyse Système Fluidique Dans la chambre danalyse : impact avec un faisceau LASER Lumière monochromatique cohérente Paramètres Optiques «Eclairage de la cellules» Taille relative : Forward Scatter ou FSC Complexité cytoplasmique : Side Scatter SSC Excitation des fluorochromes et émission de fluorescence

23 Paramètres fluorescents Pourquoi la cellule est-elle fluorescente ? Les cellules expriment des marqueurs antigéniques : –Protéines –Sucres En surface ou en intracytoplasmique Marqueurs classés en CD (Cluster de Differenciation) Sélection danticorps reconnaissant spécifiquement ces marqueurs Couplage des anticorps à différents fluorochromes Signaux fluorescents recueillis : –Nombre et type de marqueurs exprimésQualitatif –Densité dexpressionQuantitatif

24 Conversion en données numériques Recueil des signaux optiques : –Miroirs, filtres, photomultiplicateur Transformation en signaux électroniques pour une analyse informatique avec un logiciel dédié Mise en forme des données Analyse des graphes, positionnement des seuils de positivité et des populations dintérêt, statistiques

25 Applications dans un Laboratoire de Recherche Etudes de la fonction Immune Cellules Hématopoïétiques Etudes Multi-drug résistance (cancer) Etudes cinétiques (fonction cellulaire) Analyse des plaquettes Détection des Microorganismes (Bactéries, Parasites) Analyse des échantillons de lenvironnement (Giardia, Cryptospiridium) Détection Micro-Particules & Virus

26 Immunophénotypage Leucémie et Lymphomes Suivi de la maladie résiduelle des hémopathies Immunophénotypage VIH Comptes Absolus CD4 Numération cellules progéniteurs (CD34) Analyse des glycoprotéines plaquettaires Cycle cellulaire et ploïdie de tumeurs Numération des Réticulocytes Cross-Match (transplantation dorgane) Détection des Leucocytes Résiduels Applications en Biologie Médicale

27 Cytogénétique Caryotype Culture Mitoses Classement des chromosomes FISH Hybridation in situ de sondes fluorescentes

28 PCR : Polymerase Chain Reaction –Sur ADN –Sur ADN complémentaire RT-PCR Biologie Moléculaire X2 Séquençage X2 n Cycles = 2 n copies

29 Biologie Moléculaire PRAD1/BCL1/CCND1 14q32 11q13 VHVH DHDH JHJH 120kb Recherche déquivalent moléculaire de translocation –IgH-Bcl1 et t(11;14) –IgH-Bcl2 et t(14;18) Recherche dexpression dérégulée dun gène –Cycline D1 (t(11;14)) Recherche de transcrit de fusion –BCR-Abelson et t(9;22) D1 D2 D3 RT-PCR quantitative (RQ-PCR) pour le suivi des patients

30 Culture des progéniteurs hématopoïétiques EEC EEC = endogenous erythroid colonies CFU-E Formation des colonies érythroïdes « spontanées » in vitro

31 Conclusion : Orientation Diagnostique Monotypie douteuse Lymphome T CD19+5- Monotypie CD19+5+ Monotypie Score 4-5 Score Score bas Compléments CMF LLC typique : diagnostic positif Immuno- phénotypique LNH du Manteau SLPC CD5+ (LLC atypique ou autre) LNH Folliculaire LNH Zone marginale L. à Tricholeucocytes SLVL LNH lymphoplasmocytaire L. Prolymphocytaire B (Galton) Cytométrie en Flux Syndrome mononucléosique Hyperlymphocytose ou Lymphocytes atypiques Cytogénétique FISH Anatomie pathologique Biologie Moléculaire Examens spécialisés complémentaires


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