Substances étrangères à l'organisme de faible poids moléculaire

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1 Substances étrangères à l'organisme de faible poids moléculaire
Xénobiotiques Substances étrangères à l'organisme de faible poids moléculaire Médicaments polluants aliments Exposition inévitable

2 Métabolisme des xénobiotiques
Cellule (hépatocyte) XOH Phase IV XOH Phase I O 2 XOR ROH Phase II XOR Phase III X X Ex: PGP Monooxygénases P450 Ex: GST Ex: MRP Elimination : expulsion du xénobiotique inchangé ou conjugué Phase I: fonctionnalisation Phase II: conjugaison (+ hydrophile) Phase III: expulsion de conjugués ou du produit parent (ex: mdr, MRP)

3 Grande variété de substrats inconnus a priori
bcp réactions bcp d’enzymes bcp substrats bcp d’isoformes

4 Nomenclature des Cytochromes P450
CYPs impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques Familles (+de 40% de similitudes) Sous-familles (+ de 55% de similitudes) A B A B C D E J… A CYPs humains 1A1, 1B1 2A6 2B C8, 2C9 2D 6 2E1 2J2 3A4 1A A7 2B C18, 2C J A5 2A A7 3A43 CYPs soulignés: polymorphisme génétique en rouge: principaux CYPs hépatiques humains une nomenclature détaillée et mise à jour peut être consultée sur le site internet: 57 CYPs chez l’homme

5 Spécificité Relative et Chevauchante

6 Expression tissulaire des EMX
Foie Les tissus tumoraux expriment des EMX différents en quantité et en qualité Autres tissus: Peau, intestin, poumon, rein Lymphocytes, cerveau, nez…. mais Le métabolisme peut être qualitativement important par la nature des métabolites produits, toxiques, actifs….

7 Les enzymes de phase II * Transférases, T
X-OH + R-OH ---> XOR, très hydrophile ou moins réactif R Enzyme donneur Ac. Glucuronique Glucosyl T (UGT) UDPGA Glutathion Glutathion-S-T (GST) GSH Acétyl= N-acétyl T (NAT) Acétyl CoA Méthyl Methyl T (MT) SAM Sulfate Sulfo T (ST) PAPS Nombreuses isoformes, superfamilles d ’enzymes

8 Phase III Sang Bile Lumière intestinale Tubules rénaux Tissus XOR
Cellule X---> XOH---> XOR X X Bile Lumière intestinale Tubules rénaux Tissus * MDR=> pGP * MRP => 1 à 7 conjugués aussi substances endogènes hydrophiles chargées XOR

9 Le transporteur mdr (P-gp, ABCB1) affecte la distribution
des médicaments dans l ’organisme Absorption orale Intestin Excrétion fécale I.V. Espace vasculaire Excrétion uninaire Espace intersticiel

10 Xénobiotique Organi sme réponse Métabolisme et Transport EMTX Facteurs
environnementaux physiopath Facteurs génétiques Cible Réaction de l’organisme réponse Pharmacologique Toxicologique

11 Variabilité du CYP2C8 range = 2 to 35 Human Liver microsomes 40 30 20
10 20 30 40 range = 2 to 35 Human Liver microsomes

12 P450 1A2 Humain 100 200 300 . pmoles P450 1A2/mg human liver

13 CYP1A2 dans les microsomes de foie humains
2 4 6 8 . nb individuals pmoles 1A2 / mg protéin

14 Catteau et al. 1995 Comparison of CYP1A2 indexes [(AFMU+1X+1U)/17U]
Population 1 (n) Population 2 (n) p Value* Mean ±SD Mean ± SD Smoking status Smokers (164) Non-smokers (81) 6.96± ± 1.79 OC use in women Not using OC (130) OC users (53) t 6.15± ±2.36 Sex Males (n=62) Women(n=183) t 7.23 ± ± 3.23 Cigarette flavor# Blonde tobacco (87) Black tobacco (48) 0.03t 6.54 ± ± 3.59 Filter use Filter (133) No filter (31) t 6.58 ± ± 4.08 Smoking behaviour# Inhalation (127) No inhalation (36) 7.12± ±2.23 Catteau et al. 1995

15 The Early History of Pharmacogenetics
1932: First Inherited Difference in an Inherited Response to a Chemical: Inability to Taste Phenylthiourea. World War II: Hemolysis in African-American soldiers treated with primaquine. 1957: “inheritance might explain many individual differences in the efficacy of drugs and in the occurrence of adverse drug reactions” Motulsky. 1959: “Pharmacogenetics: the Role of Genetics in Drug Response”. Friedrich Vogel . 1959: Genetic influence on isoniazid blood concentrations 1964: Genetic variation in ethanol metabolism 1977: CYP2D6 polymorphism D’après Flockhardt Hippocrate + notion de terrain Table 1. The Early history of pharmacogenetics. Inter-individual differences in drug response have been familiar to scientists since 1932.

16 Substrats pharmacogénétique Spartéine: même type de résultats
Débrisoquine N C NH NH2 CYP ??? OH 4-OH-Débrisoquine N C NH NH2 Spartéine: même type de résultats

17 D’après Maghoub et al. 1977 ~95% Nombre d’individus ~5% Log, rapport métabolique, MR

18 metaboliseurs rapides metaboliseurs ultra-rapides metaboliseurs lents
. . . . metaboliseurs 20 40 60 80 100 120 rapides metaboliseurs Nombre d ’individus ultra-rapides metaboliseurs lents 12.6 ( )n 0.1 1 10 100 Log Debrisoquine / 4OH debrisoquine: RM Bertilsson and Dahl 1996

19 Polymorphismes génétiques : bases moléculaires
Pas de gène actif: lents 1 gène actif Rapides ou intermédiaires 2 gènes actifs rapides Plus de 2 gènes actifs ultrarapides Gène défectueux (délétion, mutation inactivatrice) Gène actif ( )n Amplification du gène actif

20 CYP ALLELES From

21 Déficits génétiques en enzymes du métabolisme des xénobiotiques
CYP 1A1(induction ~ 10%) CYP 2A6* (5%) CYP 2C9 (3%) CYP 2C18 (?) CYP 2C19(5-20%) CYP 2D6* (5-7%) CYP 2E1(>1%) CYP3A4/5 (?) GSTM1* (50%) GSTT1 (10-20%) GSTP1 (10%) UGT1A1 (5-10%) NAT2 (50%) EH (<5%) TPMT(<1%) * : gènes pour lesquels une duplication est connue Les fréquences varient selon les populations: ethnopharmacogénétique

22 Phénotype: Génotype: - activité réelle - quantifiable
- mise en oeuvre plus difficile - variations (xénobiotiques, pathologies) - pas permanent Génotype: - facile - permanent - pas quantifiable - pas activité réelle

23 GENOTYPAGE : outils * Méthodes fondées sur la PCR : RFLP, PCR allèle-spécifique, OLA .. (spécifiques) séquençage * Méthodes non spécifiques: SSCP, DGGE D-HPLC : ==> détection de nouveaux polymorphismes * « Carte génétique » : puces à ADN

24

25 Oligonucleotide array for cytochrome P450 genotesting
From: Flockhart DA and Webb DJ. Lancet End of Year Review for Clinical Pharmacology, 1998.

26 Conséquences cliniques ??
ou

27 Antivitamin K treatments
Public health issue à treated patients First cause of iatrogenic drug accident Antivitamin K treatments hospitalisations / year 3000 death / year

28 VARIABILITE DANS LA REPONSE
Nb de patients Doses de warfarine (mg/semaine) Observance du traitement Alimentation (vit. K) Situation physiopathologique Interactions médicamenteuses Facteurs génétiques Risque hémorragique Risque thrombotique HYPERSENSIBILITE RESISTANCE

29 INTERACTION METABOLISME/CIBLE PHARMACOLOGIQUE
AVK VKOR= Vitamine K époxyde réductase VKOR CYP2C9 VIT K réduite VIT K oxydée γGC=γglutamyl carboxylase γGC Facteurs Vit K dépendant inactifs Facteurs Vit K dépendant actifs

30 Les facteurs génétiques liés au métabolisme et
HYPOTHESE DU TRAVAIL Les facteurs génétiques liés au métabolisme et à la cible pharmacologique influencent la réponse aux AVK À partir d’une étude chez des volontaires sains (n=230) recevant une dose unique d’acénocoumarol détermination de la part génétique dans la variabilité de la réponse pharmacologique Collaboration CIC St Antoine, Pr Laurent Becquemont

31 PHARMACOGENETIQUE DES ANTICOAGULANTS ORAUX
Identification des gènes (bibliographie) Médicament Recherche de polymorphismes (SNP) (criblage, base de données) Métabolisme CYP 2C9 Analyse du promoteur et des régions codantes Cible VKORC1 Conséquences fonctionnelles Analyse par SNP et haplotype Activité transcriptionnelle et de la protéine mutante Réponse Corrélation avec la réponse Mesure du Facteur VII Part de la variabilité génétique

32 RESULTATS CYP 2C9 (région codante)
Effets des allèles CYP 2C9*2 et *3 sur la réponse à l’acénocoumarol (ratio facteur VII: J0/J24 x100 ) Répartition des génotypes: Génotype *1/*1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3 Nombre 143 44 30 4 8 1 P< 0.001 CYP 2C9 *3 CYP 2C9 *2 14% de la variabilité NS

33 ANALYSE DE LA REGION 5’ FLANQUANTE DU GENE CYP 2C9
Identification de nouvelles mutations par HPLC dénaturante, puis séquençage direct des 230 Caucasiens Variation facteur VII :- 20% (p<10-4) 5’ 3’ A1061C CYP2C9*3 C416T CYP2C9*2 G-1538A 0,085 T-1189C 0,398 G-1097A 0,136 G-982A 0,086 T-640 0,005 G-620T 0,138 NS Clin Pharm Ther 2004

34 ANALYSE HAPLOTYPIQUE DES POLYMORPHISMES DU GENE VKORC1 EN RELATION AVEC LA REPONSE PHARMACOLOGIQUE
Base de données => SNPs : reconstruction des haplotypes corrélation avec variation du facteur VII 7 haplotypes: SNP -1639G>A =« marqueur des haplotypes »

35 EFFET DE LA MUTATION VKORC1 –1639G>A
SUR LA REPONSE A L’ACENOCOUMAROL P<0.001 Variation Facteur VII Génotype VKORC1 37% de la variabilité

36 EFFET ADDITIF DE VKORC1 –1639G>A ET CYP2C9*3
SUR LA REPONSE A L’ACENOCOUMAROL Variation Facteur VII (%)

37 Variabilité dans la réponse pharmacologique de l’acénocoumarol
CONCLUSION Variabilité dans la réponse pharmacologique de l’acénocoumarol POIDS 4% CYP2C9 14% INCONNUE 37% VKORC1 CYP2C9*3 + VKORC1 G-1639A = 50% de la variabilité

38

39 Oméprazole and CYP2C19 pH EM Wt/wt 3,1 + 16 % Wt/m 5,5 +157 % Gastrin
parameter Genotype pH Gastrin EM Wt/wt 3,1 + 16 % Wt/m 5,5 +157 %

40

41 Xenobiotic Exposure Drug Metabolites Metabolites XMTE Tumor
Metabolism Transport Activation Metabolites Metabolites XMTE normal cell DNA adducts, mitogenic signal… normal cell Tumor Xenogenetics Pharmacogenetics Response

42 THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :
EXEMPLE DE LA THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) : AZATHIOPRINE 6-MERCAPTOPURINE (6MP) TPMT HGPRT XO 6-MMP 6-THIOGUANINES ACIDE THIOURIQUE ACTIFS TOXIQUES

43 ACTIVITE TPMT : DISTRIBUTION TRIMODALE
5 10 15 20 Activité TPMT, Unités/ml GR Nb d’individus, % Wt/Wt M/Wt M/M

44 POLYMORPHISME DE LA TPMT
 Structure du gène ATG Stop 5 ’ 3 ’ Répartition des allèles variants:  Principales mutations TPMT* 2 : G238C Ala Pro TPMT*3A : G460A Ala  Thr A719G Tyr  Cys TPMT*3B : G460A Ala  Thr TPMT*3C : A419G Tyr  Cys 7 % 78 % < 1 % 5%

45

46 733 732 fréquence coût C$ coût total coût C$ coût total C$ Génotype
Sans Génotypage Avec Génotypage fréquence coût C$ coût total coût C$ coût total C$ Génotype +/+ 0,89 710 632 710 632 +/- 0,11 710 78 -/- 0,003 7757 23 Génotypage 1 100 100 COÛT TOTAL C$ 733 732 Coût du génotypage de la TPMT en incluant le coût du dosage et celui des accidents de myélotoxicité Les accidents des hétérozygotes ne sont pas pris en compte.

47 Biologie coût = 100 $ / patient Gain total = 235 $ / patient
Sans génotypage Avec génotypage myelotoxicité fréquence coût C$ coût total coût coût total Génotype +/+ non 0,89 710 631,9 710 631,9 +/- non 0,11*0,70 710 54,7 +/- oui 0,11*0,30 7757 256 -/- oui 0,03 7757 23,7 Génotypage 100 100 Coût total 967,1 731,9 Coût du génotypage, incluant, le traitement (aza), le traitement de la myélotoxicité, le génotypage. 30% des hétérozygotes sont susceptibles de développer une myélotoxicité. Biologie coût = 100 $ / patient Gain total = 235 $ / patient

48 Irinotecan (CPT-11): Toxicity Prfediction
Gene UGT1A1

49 20 pts treated with CPT11 (phase 1)
Pharmacokinetics Parameters of lrinotecan and polymorphisms in UGT1A1 promoter 20 pts treated with CPT11 (phase 1) Genotype and SN38G/SN38 ratio Iyer, Pharmacogenomics J 2002

50 Neutropenia (5FU / Irinotecan) and UGT1A1 genotype
N = 76 patients (HEGP) 10 20 30 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 no severe neutropenia % (6/8)* p = 0,001 6/6 6/7 (8/39) Neutropenia Grade 3/4 (4/29) p = 0,0001 7/7 Nb of cures *: toxic death in a pt with a 7/7 génotype Nb of cures median (7/7) : 4

51 Toxicity of 5-FU / Irinotecan association and promoter polymorphisms in the thymidylate synthase gene (TS) % (4/11) p = 0,02 (5/33) (0/19) Génotype TS Lecomte, Clin Cancer Res 2004

52 Xenobiotic Exposure Drug Metabolites Metabolites XMTE Tumor
Metabolism Transport Activation Metabolites Metabolites XMTE normal cell DNA adducts, mitogenic signal… normal cell Tumor Xenogenetics Pharmacogenetics Response

53 Réponse à la chimiothérapie des cancers ORL
68% des malades ont une tumeur mutée pour p53. 87% des non répondeurs et 57% des répondeurs p(<0,003) ont une altération de p53. 4

54 Réponse à la chimothérapie des cancers ORL
Régression logistique Cabelguenne et coll. 6

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59 Clinical Applications
Anticancer drugs: 5FU, Irinotecan, Oxaliplatine Immunosuppressors : azathioprine, ciclosporine, tacrolimus UGT1A1 DPD TS GST Pharmacogenetics Molecular oncology Clinical chemistry HEGP TPMT CYP3A4/5 MDR-1 Anticoagulants : warfarine, acenocoumarol Psychotropes CYP2D6 CYP2C9

60 INTERET DE LA PHARMACOGENETIQUE
*Les variations du métabolisme /transport ont des conséquences: - pharmacocinétiques - pharmacodynamiques - toxiques * Le rôle du métabolisme / transport est important quand: - la fenêtre thérapeutique est étroite - l’efficacité est difficile à évaluer rapidement * Il est possible de prédire la capacité métabolique - génotypage - phénotypage

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62

63 De l’exposition au cancer
Détoxification Elimination Exposition Métabolisme Adduits Promotion Progression Cancer Réparation

64 Xénobiotic XMTE DNA Exposure Activation/détoxication Elimination
réactive Métabolite DNA Répair DNA-adduct Exposure + metabolism Mutation molecular signature escape Cancer

65 Lung Cancer Metabolism Exposure Cancer Benzo(a)Pyrene (BaP)
CYP1A1 (AhR induction) EH / EH 7,8 époxide BaP Metabolism UGT 7,8 diol BaP CYP1A1 (AhR induction) Diolepoxide (BPDE GSTM1,P1; EH? in vivo, in vitro p53: 173, 248, 273 Repair DNA Adducts (BPDE-G) in vivo, p53: 173, 248, 273 Mutation Escape Cancer

66 light intermediate heavy Total GST+ 1.0 6.0 13 GST- 1.8 8.0 15
Smokers light intermediate heavy Total GST GST AdénoK GST GST Small cell GST GST Stucker et coll. 1996

67 Odds Ratio in lung cancer as a function of: - inducibility of CYP 1A1
- GST M1 Stücker et coll.

68 Rô l e d e l a GS T P1 d an s l e r isq u e d e ca n ce r d u p ou m
on S u jet s C o n tr ô l e C a n c er O R P e tit es O R P o um o n c e l lul es G S T P 1 AA + 9 2 , 4 8 8 8 3 , 3 A G G G 7 , 6 1 2 2 1 6 . 7 3 , 6 ( 1 -4, 1 ) ( 1 ,3- 9 , 8 ) Loriot et coll. 2

69 Lung Cancer Metabolism Exposure Cancer Benzo(a)Pyrene (BaP)
CYP1A1 (AhR induction) EH / EH 7,8 époxide BaP Metabolism UGT 7,8 diol BaP CYP1A1 (AhR induction) Diolepoxide (BPDE GSTM1,P1; EH? in vivo, in vitro p53: 173, 248, 273 Repair DNA Adducts (BPDE-G) in vivo, p53: 173, 248, 273 Mutation Escape Cancer

70 - Modification de l’activité:
Certaines substances peuvent faire varier l’expression des EMX et en particulier des CYPs. - Modification de l’activité: quantité d’enzyme constante, activité variable activation, inhibition - Modification de l’enzyme Quantitative: induction, répression Qualitative: modification post-traductionnelle

71 Induction: augmente métabolisme, diminue concentration
- inductibilité variable - conséquence dépend des médicaments - autres effets: PGP, absorption..... Inhibition: diminue métabolisme augmente concentration - dépend des affinités et des concentration (I/Ki) - dépend des xénobiuotiques, médicaments - spécificité en fonction de la concentration (I/Ki)

72 Inducteurs de cytochromes P450
Certains d’entre eux induisent d’autres EMX, UGT, GST…

73 ADN Transcription RUN-ON ARN Maturation ARNm Analyse ARN ARNm ARN stabilité traduction traduction in vitro Degradation Protéine Analyse protèique activité immunologie modification PT Post-traduction stabilité protéique Protéine

74 I = inducteur I R + R I noyau R I transcription cellule

75 Les récepteurs impliqués dans l’induction
* Dioxine, HAP: AhR + ARNT + AhRR? CYP1A1 Variabilité dans induction * Barbituriques: CAR CYP2B6 * Rifampicine: PXR, SXR (GR) CYP3A4

76 Mécanismes d’induction
- à tous les niveaux: transcriptionnel, post transcriptionnel, traductionnel et post traductionnel 1-25 OHD3 X X X, AG GR RXR VDR RXR PXR CAR RXR AhR ARNT PPAR RXR Transcription de CYPs 1A1, 1A2, UGT, GST, AlDH Transcription de CYPs 4A Transcription de CYPs 3A4, 2B6, 2C9, 2C19, mdr

77 Métabolisme de la vitamine D
CYP3A4 CYP2D6?

78 Métabolisme de l’acide arachidonique

79 CYP3A4 CYP2D6 LXR CYP3A4 CYP2D6 FXR PXR

80 Cholestérol SHP CYP7A, 8B 3A, 2D6 ? FXR PXR Acides Biliaires OATP2 CYP3A BSEP ABOHu ABbil

81 CAR CAR CAR Interactions récepteurs/endobiotiques/xénobiotiques Néo G
ß-oxydation tumorigenèse CYP UGT ALDH CAR - + CAR LXR Cholestérol CYP7A FXR PXR CAR AB Stéroïdes Élimination (CYP,UGT,ST)

82 Autres mécanismes impliqués dans l’induction
- stabilisation de la protéine: CYP2E1/éthanol - déstabilisation du méssager : insuline/CYP2E et 2B - stabilisation du messager CYP1A2 et HAP - modification post-traductionnelles (phophorylations CYP2E)

83 Inhibition des EMX * inhibition réversible (cimétidine) et irreversible (TAO, Gestodène) * médicaments /substrats=> interactions médicamenteuses, aliments Constantes d ’affinité: Km/Ki à manipuler avec précautions * exemples: CYP 3A4: Ketoconazole, ritonavir, jus de pamplemousse CYP1A2: fluvoxamine, furafylline CYP 2C9: sulfaphenazole CYP2C19: omeprazole CYP2D6: quinidine, paroxétine CYP2E1 disulfiram

84 v = Vm S Km + S (1+ I/Ki) Med1(S) Met 1 Km CYP3A4 Ki Med2 (I) Met 2

85 Inhibiteurs des CYPs ! Ki et concentration tissulaire réversible et
Irréversible ± spécifique

86 Conséquences de l’induction ou de l’inhibition
* Modification de la production de métabolites: * Toxicité: production métabolite toxique * Effets exagérés: accumulation du produit * inéfficacité: élimination trop rapide, pas de production de métabolite actif * ! Absorption aussi entre en ligne de compte (MDR)

87 Phénotype: Génotype: - activité réelle - quantifiable
- mise en oeuvre plus difficile - variations (xénobiotiques, pathologies) - pas permanent Génotype: - facile - permanent - pas quantifiable - pas activité réelle

88 Phénotypage in vivo CYP 1A1 : induction lymphocytes EROD
CYP 1A2 : caféine sang PX/C (NAT2) CYP 2A6 : Coumarine CYP 2C9 : Diclofenac CYP 2C19: Méphénytoïne, Proguanil, Oméprazole CYP 2D6 : Debrisoquine, Spartéine, Dextromethorphane CYP 2E1 : Chlorzoxasone CYP 3A4 : 6-ß-OH-Cortisol (induction), 13, 14 (C)Erythromycine, Midazolam, Dapsone,

89 Polymorphismes génétiques
enzyme % phénotype génotype GST M oui act. oui GST T oui act. oui GSTP non oui NAT1 ? oui test oui NAT caféine oui EH oui act. oui TPMT 0,5 oui act. oui MT ST

90 Polymorphismes génétiques
enzyme % phénotype génotype CYP 1A1 <1 induction oui CYP 1B1 <1 non oui 2A6 coumarine oui 2C9 diclofenac oui 2C18 ? ? oui 2C Meph, omé, pro oui 2D Debris,Dextro, Spart oui 2E1 <1 Chlorzoxasone oui 3A ? ?

91 GENOTYPAGE : outils * Méthodes fondées sur la PCR : RFLP, PCR allèle-spécifique, OLA .. (spécifiques) séquençage * Méthodes non spécifiques: SSCP, DGGE D-HPLC : ==> détection de nouveaux polymorphismes * « Carte génétique » : puces à ADN

92

93 But: prédire métabolisme d’un médicament administré à un patient
Questions: - Quels sont les métabolites produits ? - Quels sont le ou les enzymes responsable(s) de la production de ces métabolites ? - Quelles sont les conséquences in vivo du métabolisme - efficacité, toxicité, interactions médicamenteuses - Quelle est la variabilité individuelle de la réponse due au métabolisme (induction, pharmacogénétique…)?

94 * Early in drug development
* Small quantities of product * Qualitative, quantitative ? * In man

95 Outils - animaux entiers, humanisés - tranches,
- cellules (hépatocytes, lignées) - fractions sub-cellulaires - enzymes purs (purification, enzymes recombinants) - sondes, anticorps - modèles moléculaires cellulaire moléculaire

96 Enzymes purs - Activité (métabolites) - production de métabolites
- constantes cinétiques Km, Vm, Ki - effets in situ des métabolites - effets de l’expression des CYP - mutagenèse - production d’anticorps * quantité CYP * immuno-histochimie * immuno-inhibition

97 Human liver 1 * Hepatocytes, slices - metabolites, conjugation - toxicity - induction --> drug interactions - difficult to obtain - reproducibility

98 Human liver 2 * hepatocytes - long time in culture (up to 1 month) - 1 cell type - transport (doublet) - no cell-cell interaction

99 Human liver 3 * slices - easy handling - cell-cell interactions - other organs (kidney) - histochemistry - short-term culture (72 h.) - high oxygenation (necrosis)

100 Induction in human slices and hepatocytes of CYPs by CPA and PB
CYP 2B6 mRNA S CYP 2B6 protein H S C CPA C CPA C PB CPA Std 24h h h H CYP 3A4 mRNA S CYP 3A4 protein H S C CPA C CPA C PB CPA Std 24h h h H. Martin, V. Albaladejo, I. de Waziers, Aventis, U490

101 Induction in human slices and hepatocytes
of CYP2B6 by CPA and PB mRNA Protein Activity Hepatocytes CPA PB Slices

102 Human liver 4 *Sub cellular fractions - microsomes (CYPs, EH, UGT…)
- cytosol (ST, NAT, GST…) - S 9000 (S 9) both ER and cytosol

103 Human liver microsomes
* contain all hepatic CYPs * variability C Y P 2 E 1 D 6 8 9 CYP3A CYP1A2 other CYPs CYP2C9 CYP2C8 CYP2B6

104 Human liver microsomes
* Enzyme(s) responsible for the production of a metabolite - correlations quantity of enzymes/ activity - immunoinhibition - represent whole human liver * Enzyme kinetics VM, KM ! * Drug interactions inhibition / activation - reversible / irreversible - Ki ---> prediction in vivo ??? * Use in association with recombinant enzymes

105 Cell lines * Hepatomas, other origins…
* Expression of XME and particularly CYPs: low ---> cannot be used directly for drug metabolism * Induction, mechanisms with or without transfection * Can be used as support for transfection - CYPs ---> in situ effect of metabolism - Transcription factors --> CYP expression

106 Pure enzymes * Purification * Recombinant enzymes

107 Bacteries Levures cellules d’insectes Cellules mammifères - production
(enzymes, anticorpss) - activité - toxicité in situ Levures - production d’enzymes - activité - microsomes cellules d’insectes - haut niveau de production - “baculosomes” Cellules mammifères - faible production - effets in situ * métabolisme * expression Commercialement disponibles

108 Pure enzymes 2 - Activity (metabolites) - Metabolite production
- Kinetics constant Km, Vm, Ki - in situ effects of metabolites - effects of CYP expression - mutagenesis - Antibody production * CYP quantity * immuno-histochemistry * immunoinhibition

109 CYP 2B6 EXPRESSION IN EXTRAHEPATIC TISSUES
Adipocyte Placenta Lung Putamen Intestine Colon Kidney liver CYP 2B6 CYP2B6 is expressed in liver, lung, kidney, intestine and brain

110

111 Med -------> med: stratégie générale E?
- mise au point analytique, dosage conditions - production générale (animaux, hépatocytes, tranches…) - microsomes, constantes cinétiques, corrélations - inhibiteurs chimiques anticorps - enzymes purs ( prise en compte de leur quantité relative) - modèles moléculaires

112 Prédiction des métabolites
- système de métabolisation (animaux , tranches, hépatocytes…) - système analytique performant ( HPLC, SM, RMN, radioactivité…) Prédiction des enzymes - stratégie maintenant bine mise au point, courante dans les laboratoires académiques et industriels.

113 In vitro Metabolism of proguanil
5 4 3 V (pmol/mg/min) 2 1 low affinity Enzyme high affinity 10 20 30 40 V/S Becquemont et al. J. Pharm. Exp. Therap 1997

114 Influence of substrate concentrations used in vitro
5 V = pmol / min / mg prot. 4 3 2 1 CYP 3A4 : 10 to 20 % 20 to 30% 30 to 50 % ,1 1 10 100 1000 PROGUANIL µM

115 In vitro Metabolism of proguanil
0.1 0.2 0.3 0.4 V (picomoles/min/pmoles CYP) CYP1A2 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2E1 CYP3A4 human recombinant CYP

116 In vitro Metabolism of proguanil (recombinant CYP2C19)
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Km = 37 ± 7 µM Vm = 0.47 ± 0.03 V (picomoles/min/picomoles CYP2C19) 100 200 300 400 500 proguanil (µM)

117 Interaction proguanil - omeprazole
0.015 62 % d’inhibition 0.01 no inhibitor V omeprazole 0.005 1 10 100 1000 proguanil

118 In vivo interaction proguanil-omeprazole in human
65 % d’inhibition 40 30 Partial metab clearance 20 prog/cyclo; l/h 10 proguanil + Proguanil + oméprazole placebo

119 N-desmethyl clomipramine
Human liver microsomes: Vm: 73 nmol/h/mg microsomal protein Km: 75 µM At 10 µM: v = Vm x S Km + S = 73 x 10 = 8.6 nmol/h/mg Yeasts: The concentration of each CYP is important; v = rate at 10 µM Clo for each CYP c = hepatic concentration of each CYP v x c pmol/h./mg 1A1 <10 1A2 12 2C8 155 2C9 2000 2C 2C 2D6 1160 3A4 6400 Total nmol/h/mg K. Kramer-Nielsen and K. Brosen

120 Procainamide métabolism (N-hydroxylation)
1A1 1A C8 2C9 2C18 2C19 2D A4 3A5 1A1 1A2 2A6 2B6 2C8 2C D6 2E1 3A4 Yeast Human lymphoblastoid cells Procainamide métabolism (N-hydroxylation)

121 Human liver and recombinant enzymes
- metabolites, enzymes - kinetics constant - qualitative prediction in vivo - quantitative prediction in vivo * hepatic concentration of the drug * hepatic concentration of enzymes - drug interactions - drug efficacy and toxicity

122 In silico prediction, molecular models
- few models - Substrate, protein - substrate specificity - mutations effects - mutagenesis - epitope autoantibodies

123 CYP2D6 de Groot and Vermeulen 1996

124 A, two views depicting the structure of flurbiprofen complexed with 2C9dH
Wester, M. R. et al. J. Biol. Chem. 2004;279:

125 A, two views of the secondary and tertiary structure of 3A4
Yano, J. K. et al. J. Biol. Chem. 2004;279:

126 Structure of CYP2C8 and the fatty acid binding site at the dimerization interface
Schoch, G. A. et al. J. Biol. Chem. 2004;279:

127

128 Conclusions: - Tools are available to predict drug metabolism in vivo from in vitro data; - qualitative, quantitative; - analytical methods; - drug interactions (inhibition, induction); - drug, enzyme concentration; - mechanistic studies; - in silico.